PH1731 | TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒 （显色法）/ TUNEL Apoptosis Detection Kit

货号 PH1731
名称 TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒 （显色法）/ TUNEL Apoptosis Detection Kit Ver2.0
规格 20T | 50T


试剂组分

Componets 20T 50T Storage

50x proteinase K（选用） 100ul 250ul -20℃ 避光
10x Enzyme Reagent 100ul 250ul -20℃
1x Labeling Substrate 900ul 2250ul -20℃
10x POD  Reagent 100ul 250ul -20℃
10x DNase I 100ul 250ul -20℃
1× DNase I Buffer 900ul 2250ul -20℃
20× DAB Reagent A 50ul 125ul -20℃ 避光
20× DAB Reagent B 50ul 125ul -20℃ 避光
*有效期12个月


产品简介
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，TdT）的催化下加上绿色荧光探针FITC标记的dUTP，之后经过POD转换试剂将信号转化成显色反应，方便结果的分析与保存。Tunel细胞凋亡检测试剂盒不依赖生物素系统进行末端标记，避免了内源性生物素产生的高背景等问题。


操作步骤
 
A. 对于贴壁细胞：

a. 接种于24/48/96孔板的细胞用PBS漂洗5min。
b. 预冷的4%多聚甲醛于4℃固定细胞30-60min。
c. PBS漂洗细胞3次，每次5min。
d. 加入含0.1%-0.2% Triton X-100 的 PBS（现用现配），冰浴2-5min
e. 转至步骤2


B. 对于悬浮细胞：

a. 收集0.5-2×10⁶ 个细胞，PBS漂洗一次 , 1000rpm 离心5min
b. 预冷的4%多聚甲醛于4℃固定细胞30-60min
c. PBS漂洗一次
d. 加入含0.1%-0.2% Triton X-100的PBS（现用现配），冰浴2-5min
e. 转至步骤2


C. 对于石蜡切片：

a. 脱蜡，组织切片置于60℃恒温箱，烤片30-60min，浸入装有新鲜二甲苯的染色缸，室温放置15min。浸入另一个装有新鲜二甲苯的染色缸，重复一次。
b. 洗涤，组织切片浸入100%乙醇染色缸，室温放置10min。浸入另一个100%乙醇染色缸，重复一次。
c. 水化，组织切片浸入梯度浓度乙醇溶液（90%，80%，70%，50%），室温下每步放置3min。
d. 组织切片浸入PBS，室温放置5min。
e. 组织切片用柠檬酸缓冲液（PH=6.2）进行中火修复5min。（对于有些组织可以用1xProteinase K进行通透，即每个组织滴加50μl用PBS稀释的1×Proteinase K，室温静置15-30min，具体通透时间因组织而异，需要自行摸索）


表1. 准备用于通透的1×Proteinase K缓冲液

1×Proteinase K 50ul反应中所需体积 反应数 总体积
50×Proteinase K 5ul × =  
PBS 45ul × =  
f. 组织切片浸入PBS 室温放置5min 重复漂洗3次，如果用Proteinase K通透则必须彻底去除残留Proteinase K 否则影响后续实验结果
g. 转至步骤2


D. 对于冰冻切片 :

a. 预冷的4%多聚甲醛于4℃固定切片30-60min
b. 组织切片浸入PBS，室温放置5min，重复漂洗2次
c. 组织切片用柠檬酸缓冲液（PH=6.2）进行中火修复5min。
d. 组织切片浸入PBS 室温放置5min 重复漂洗3次，如果用Proteinase K通透则必须彻底去除残留Proteinase K 否则影响后续实验结果
e. 转至步骤2


2. 每个组织或细胞样本滴加50ul 3% ，室温避光静置10min。

表2. 准备用于封闭的3% H2O2缓冲液

3% H2O2 50ul反应中所需体积 反应数 总体积
30% H2O2 5ul × =  
甲醇 45ul × =  

3. 组织切片或细胞浸入PBS 室温避光放置5min 重复漂洗2次。

4. 阳性对照（选做）: 阳性对照的组织滴加50μl阳性对照缓冲液 24孔板每孔大概需要100-150μl 室温静置10min ，浸入PBS 室温放置5min 重复漂洗3次。

表3. 准备用于实验的阳性对照缓冲液

阳性对照缓冲液 50ul反应中所需体积 反应数 总体积
10xDNase I 5ul × =  
1×DNase I Buffer 45ul × =  


注：为避免交叉污染，阳性对照组请用单独的染色缸漂洗！

5. 每个组织滴加50μl Tunel反应缓冲液（24孔板每孔大概需要100-150μl）， 37℃，避光孵育60-90min。

表4. 准备用于实验的Tunel反应缓冲液


Tunel反应缓冲液 50ul反应中所需体积 反应数 总体积
10xEnzyme Reagent 5μl-7μl × =  
1xLabeling Substrate 43μl-45μl × =  
 
6. 阴性对照（选做）：用于进行阴性对照的组织或细胞滴加不含10×Enzyme Reagent 的Tunel反应缓冲液（45μl 1×Labeling Substrate与5μl去离子水混合），37℃，避光孵育60-90min。

7. 组织切片或细胞浸入PBS，室温放置5min，重复漂洗3次。

8. 每个组织滴加50μl POD转换缓冲液（24孔板每孔大概需要100-150μl），37℃，孵育30min。

表5. 准备用于封闭的POD转换缓冲液

POD转换缓冲液 50ul反应中所需体积 反应数 总体积
10xPOD Reagent 5ul × =  
PBS 45ul × =  

9. 组织切片或细胞浸入PBS , 室温放置5min 重复漂洗3次

10. 每个组织或细胞样本滴加50 DAB显色剂（24孔板每孔大概需要100-150 室温孵育2-5min 根据实际显色情况 自行摸索显色时间。

表6. 准备用于实验的DAB显色剂

DAB显色剂 50ul反应中所需体积 反应数 总体积
20×DAB Reagent A 2.5ul × =  
20×DAB Reagent B 2.5ul × =  
PBS 45ul × =  

11. 复染细胞核：用苏木素复染细胞核，（组织染色1min，细胞染色数秒）。

12. A. 对于贴壁细胞或细胞涂片：蒸馏水返蓝后，用50%甘油封片，随即进行显微镜观察；


12. B. 对于切片：用1%盐酸酒精分化数秒，自来水返蓝。之后进行一下步骤：

a. 脱水，组织切片浸入梯度浓度乙醇溶液（50%，70%，80%，90%），室温下每步放置3min；

b. 洗涤，组织切片浸入100%乙醇染色缸，室温放置10min。浸入另一个100%乙醇染色缸，重复一次；

c. 透明，组织切片浸入装有新鲜二甲苯的染色缸，室温放置15min。浸入另一个装有新鲜二甲苯的染色缸，重复一次

d. 中性树胶封片，通风橱内晾干，置于显微镜下观察。