PH9143 | 彗星法DNA损伤试剂盒 DNA Damage Assay kit

产品简介

DNA 在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破坏，磷酸二脂键的断裂，碱基的破坏或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于贴敷载玻片上的低熔点琼脂糖中，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使 DNA 分子解旋。将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA 分子向阳极移动。如果 DNA 损伤严重，碎片多，则电泳速度快。未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。

本试剂盒采用低毒的 PI 对凝胶进行染色即可观察到 DNA 受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。也可用相关的软件作定量分析(如：CASP 彗星分析软件)。

试剂组分

试剂盒以外自备仪器和试剂

1.5 mL 离心管、0.4 mM Tris-HCl（pH7.5）缓冲液、PBS（飞净：PH1812），低温高速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37-45℃水浴锅、盖玻片、平皿、微量移液器。

运输与存储：常温运输，2～8℃保存，有效期12个月

操作步骤

1. 细胞收集：细胞用预冷的 PBS 洗一次，离心收集，用适当体积的 PBS 重悬调整其密度为 1×106个/mL；

2. 铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用 PBS 配制，典型浓度为 1%(w/v)，可按照 1 mg 琼脂糖溶于 100 μL PBS进行等比例配制。

① 第 1 层凝胶的制备：将载玻片的需要做标记的磨砂面向上，将 100 µL 的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)在 90-100℃下水浴加热溶化，注意盖紧管盖，防止高温爆裂或挥发，如有挥发可用 ddH2O 补足，然后铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置 2-8℃下 10 min 使 NMA 凝固。

② 第 2 层凝胶的制备：将 10 µL 细胞（约 104个）和 75 µL 的 0.7%低溶点琼脂糖 LMA 在 60-80℃下水浴加热使之完全溶化，混合均匀。然后，轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的 LMA 滴到第 1 层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置 2-8℃，10 min 使第 2 层 LMA 凝固。

③ 第 3 层凝胶的铺制：第 2 层 LMA 凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加溶化的 75 µL 的 0.7%低溶点琼脂糖 LMA，如上盖上盖玻片 2-8℃下凝固（第三层覆盖第二层周围 0.5 mm，增加凝胶化作用时间至 30 min，高湿度环境）。

3. 细胞裂解：移去盖玻片，将玻片置于平皿中，倒入预冷的 Lysis Buffer（使用前每 9 mL 加入 1 mL的 DMSO），2-8℃ 裂解 1-2 h，取出载玻片用 PBS 漂洗。

4. DNA 碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液(用户自备：含 1 mM EDTA，300 mM NaOH)，约覆过载玻片胶面 0.25 cm 左右，室温放置 20-60 min，以便使 DNA 在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使 DNA 断链在电场中易于迁移。

5. 单细胞电泳：设置低电压 25 V(~ 0.75-1 V/cm)，电泳 20-30 min，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节，建议避光，2-8℃电泳（可在水平电泳槽周围铺放冰袋控温）。

6. 中和染色：电泳后将载玻片置于平皿内。加 0.4 mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，没入载玻片，2-8℃中和三次，每次 10 min，弃去 Tris-HCl 缓冲液，每载玻片加 20 µL Propidium Iodide（PI）染液，盖上盖玻片，避光染色 10 min。

7. 观察、拍照和分析：荧光显微镜 515-560 nm 波长的激发光、PI 染色的 DNA 呈红色，可清楚地观察到核 DNA 和迁移的 DNA(即彗尾)。每个样本随机选择 100 个细胞，测定核 DNA 直径和 DNA 迁移的长度，可并用相应的软件分析。DNA 损伤按彗星尾部 DNA 量占全部 DNA 量的比例分为 5 级：0级：＜5%无损伤；1 级 5~20%轻度损伤；2 级 20~40%中度损伤；3 级 40~95%高度损伤；4 级＞95%重度损伤。

注意事项

Propidium Iodide（PI）操作时要戴手套。